退火温度較低,可以提高2到3度Mg離子濃度一般的PCR在1.5mM就可以了,不知樓主用的多少,模板濃度較高或者含有其他PCR抑制劑,建議稀釋下模板,延伸時間一般1kb/min,時間太短可能會延伸不完全,循環數太高也可能引起拖帶,考慮平台期,30-35循環應該足夠了