用同一種限制性核酸內切酶分別把DNA分子及要插入的DNA切出黏性末端。然後把帶有相同黏性末端的DNA混合在一起,加入DNA連接酶就可以把一段DNA插入到另一段DNA中。之後用選擇培養基把所需要的重組DNA篩選出來。因為把要插入的DNA為A,被插入的DNA為B,DNA連接酶連接後出現AA,BB及AB連接,而所需要的是AB連接。