在自然界裡，食用菌都不是單獨存在的，而是和許多細菌、放射菌、黴菌等生活在一起的。所謂菌種分離，就是把這些和食用菌一起生活的雜菌分離出來，通過培養，獲得純的優良菌種。菌種分母種、原種、栽培種。
(一）母種的分離培養
食用菌母種的分離，可分為孢子分離法、組織分離法以及基內菌絲分離等。
1、孢子分離法
孢子分離法，是用食用菌的有性孢子或無性孢子萌發成菌絲，培養成菌種的方法。這種菌種生活力較強，但孢子個體之間有差異，且自然分化現象較嚴重，變異大，需經出菇試驗才能在生產上應用。
（l）單孢分離法：是每次或每支試管只取一個擔孢子， 讓它萌發成菌絲體來獲得純菌種的方法。蘑菇和草菇用單孢分離得到的菌絲，有結實能力，可採用此法分離生產純菌種。單孢分離生產上較少採用，而且技術複雜，一般採用多孢分離法。
（2）多孢分離法：就是把許多孢子接種在同一培養基上，讓它們萌發、自由交配來獲得食用菌純菌種的一種方法。具體操作方法，有以下幾種：
①種菇孢子彈射法：選擇個體健壯、朵形圓正，無病蟲害、出菇均勻、高產穩產，適應性強的八九分成熟的種菇，切去大部分，菌柄用無菌水沖洗數遍後再用已滅菌的紗布或脫脂棉、濾紙吸乾表面水分。在接種箱或無菌室內，把種菇的菌褶朝下用鐵絲倒掛在玻璃漏斗下面，漏斗倒蓋在培養皿上面上端小孔用棉花塞住。培養皿放在一個鋪有紗布的搪瓷盤上，靜置12～20小時，菌褶上的孢子就會散落在培養皿內。形成一層粉末狀孢子印（平菇極淡紫色，蘑菇、草菇 為褐色，香菇、金針菇孢子印白色）。用接種針沾取少量孢子在試管中的瓊脂外面或培養皿上劃線接種。待孢子萌發，生成菌落時，選孢子萌發早、長勢好的菌落進行試管培養。
還可用孢子採集器收集孢子。方法是選好種菇後，按上述程式，輕輕掀開玻璃鐘罩，將種菇柄朝下插在孢子採收器的鋼絲架上，放在培養皿正中央。隨即蓋好玻璃罩，用紗布將鍾掌周圍塞好。並在紗布上倒少許昇汞或無菌水。移入 20℃左右恆溫箱培養。
②褶上塗抹法：按無菌操作分離時應選擇成熟的種菇，用接種針直接插入褶片之間，輕輕抹取褶片表面子實體尚未彈射的孢子，再在培養基上劃線接種。
③鉤懸法：取成熟菌蓋的幾片菌褶或一小塊耳片（黑木耳、毛木耳、白木耳〕，用無菌不鏽鋼絲（或鐵絲、棉線等其他懸掛材料）懸掛於三角瓶內的培養基的上方，勿使接觸到培養基或四周瓶壁。置適宜溫度下培養、轉接即可。
④貼附法：按無菌操作將成熟的菌褶或耳片取一小塊， 用溶化的瓊脂培養基或阿拉伯膠、漿糊等貼附在配管斜面培養基正上方的試管壁上。經6～12小時的培養，待孢子落在斜面上，立即把孢子連同部分瓊脂培養基移植到新的試管中培養即可。
孢子分離得到的母種、必須進一步提純復壯，當母種定植一星期左右，菌絲布滿斜面時，選擇菌絲健壯、生長旺盛無老化、無感染雜茵的母種試管，進而轉管擴大，一般到栽培種，轉管不宜超過5次。
孢子分離得到的母種，必須通過出菇試驗，鑑定為優質菌種後，才可供生產使用。
一般菌類如蘑菇、平菇、鳳尾菇、香菇、冬菇和草菇等，都可用多孢分離法獲得母種。
現就銀耳孢子分離略述於下：
按無菌操作獲取種耳後，懸掛種耳的三角瓶經12小時培養後，瓶底培養基表面就有"孢子印"。取出種耳，置 20℃—25℃溫箱培養2～3天，培養基表面會出現乳白色透明的糊狀小菌落，就是銀耳的酵母狀分生孢子形成的少量銀耳菌絲。此時移接入試管斜面培養基上，待長滿斜面後，再移接入營養豐富，且表面比較乾燥的培養基上。經30天左右，菌落長出白色菌絲。
銀耳的酵母狀分生孢子、菌絲只有與羽毛狀菌絲的子囊菌（香灰菌絲）混合培養時，由後者幫助分解木材及其他一些纖維物質，提供營養，才能利於銀耳孢子萌發，菌絲的定植和子實體的形成。
在兩種菌絲交會時，先選出兩種純菌絲。
羽毛狀菌絲要純化選育，一般要選取生長迅速，爬壁力強的試管斜面或種瓶，取先端菌絲，轉管移接，置25℃—28℃上培養，重複轉管幾次即可得到優良純種。
銀耳菌絲的特點，菌絲生長緩慢，擔孢子也不易萌發。在進行兩菌混合時，先取經8～IO天培養的銀耳菌絲斜面，按無菌操作方法在該斜面上距銀耳菌絲約0.5釐米處接入一 小塊羽毛狀菌絲。置25℃下培養1周即得到混合好的銀耳母種。
2．組織分離培養法
利用子實體內部組織，進行無性繁殖而獲得母種的簡便方法，即組織分離。該法操作簡便，菌絲生長髮育快，品種特性易儲存下來，特別是雜交育種後，優良菌株用組織分離法能使遺傳特性穩定下來。常採用以下分離方法。
（l）子實體分離：種菇要選朵大蓋厚，柄短，八九分成熟的優良品種。切去菇兩基部，在無菌箱內以0.1％的昇汞水浸幾分鐘，再用無菌水沖洗並揩乾或用75％酒精棉球擦拭菌蓋與菌柄2次，進行表面消毒。接種時，只要將種菇撕開，在萌蓋和菌柄交界處或菌褶處，挑取一小塊組織移接 到PDA培養基上。置25℃左右溫度下培養3-5天，就可以看到組織上產生白色絨毛狀菌絲，轉管擴大即得到菌種。如香菇、平菇等可以用此方法。
（2）菌核分離：茯苓、豬苓、雷丸等菌的子實體不易採集。而常見的是它貯藏營養的菌核。用菌核分離，同樣可以獲得菌種。方法是將菌核表面洗淨，用酒精或昇汞消毒後，切開菌核，取中間組織一小塊，約黃豆大小，接種在PDA 培養基斜面上，保溫培養。應注意的是，菌核是貯藏器官，大部分是多糖類物質，只含有少量的菌絲，因此挑取的組織塊要大一些，如果組織塊過小，則不易分出菌種。
（3）菌素分離：有一部分子實體不易找到，也沒有菌核，可以用菌素進行分離。如蜜環菌、假蜜環菌。其操作方法是先用酒精或昇汞將菌素表面黑色皮層輕輕擦拭2～3次， 然後去掉黑色外皮層（菌鞘），抽出白色菌髓部分用無菌剪刀將菌髓剪一小段，接種在培養基上，保溫培養，即得該菌菌種。
菌素分離要注意：因菌素比較細小，分離素也比較細小，分離時極易汙染雜菌，所以要嚴格操作。
3．基內菌絲分離培養法
利用食用菌生育的基質作為分離材料，來得到純菌種的一種方法，叫基內菌絲分離法。
此種分離方法是適宜只有在特定的季節才出現，而且是朝生暮死，不易採得的子實體。基內分離法與組織分離法不同之點是，乾燥的菇木或耳木中的菌絲常呈休眠狀態。接種後有時並不立刻恢復生長。因此，有必要保留較長的時間（約1個月），以斷定菌絲是否能成活。基內菌絲分離法又可分為，材中菌絲分離（即菇木或耳木分離法）及土中菌絲分離法等。
（1）材中菌絲分離法：就是菇木或耳木分離法，為了減少雜菌的感染，菇（耳）木在分離之前，必須進行無菌處理。可以把菇（耳）水錶面用酒精燈火焰輕輕燒過，以燒死黴菌的孢子，或再用0.1％的昇汞水浸孢幾分鐘，然後用無菌水沖洗後用無菌濾紙吸乾。接種塊切取時應注意。接種塊必須在該菌菌絲分佈的範圍內切取。所以，菌絲生長緩慢的種類應淺取菌種生長快的種類可以深取。同時。還應根據菇菌的種類、木材質地、菇（耳）木粗細、發育時間的長短來確定菌絲分佈的範圍。然後用一把利刀進行切取。接種塊應儘量小些，以減少雜菌感染機會，提離菌種的純度。接種塊移到培養基上，就應該放到適合菌絲生長的22℃～26℃ 的溫室或溫箱中培養，使菌絲恢復生長。
（2）土中菌絲分離：食用菌種類很多，許多土生的食用菌孢子不易萌發。組織分離也不易成功，用土中菌絲分離獲得純種的方法，叫土中菌絲分離。
土中菌絲分離時要注意，由於土中菌絲體的周圍生活著多種多樣的土壤微生物，因此分離時必須儘可能避開這些微生物的干擾，儘可能批取清潔菌絲素的尖端、不帶雜物的菌絲接種，反覆用無菌水沖洗，在培養基中加入一些抑制細菌 生長的藥物，如 40微克／升的鏈黴素或金黴素。如發現感染細菌，可以把菌落邊緣的菌絲挑出來，接種到木屑培養基中。因細菌沒有分解木質素的能力，因此在木屑培養基中不易擴充套件只侷限於接種處。待菌絲長出感染區後，就可以再進行擴大提純了。
（3）子實體基部分離：從瓶栽、袋栽或大床栽培的子實體基部分離出新菌絲的方法，叫子實體基部分離，現以袋栽銀耳為例說明：
從出耳早、出耳率離、無病蟲害的栽培室中選擇生活力最強的幼耳5袋，移到氣候溫和，有散射光的野外場所進行後期培養，以增強菌絲體的生活力。經培養7～10天后，待子實體直徑達4～5釐米時便可取回，作為分離的母體。再從中篩選最理想的一朵，用利刀割掉銀耳子實體，放置於 0℃的冰箱或有敵敵畏的容器中過夜，以便殺死瓶中的害蟲。然後用75％酒精或昇汞擦洗耳基和袋子外邊的雜質，連同接種工具、接種培養基等移進無菌室。經滅菌後，用接種刀把袋口上部約15毫米厚的老菌根挖除，並進行培養。待袋口露出白色菌絲時，用接種針挑取一塊半粒米大的白色菌結體，迅速移入母種試管培養基的中央，輕輕地脫去接種針， 塞上棉塞。 為了能夠獲得較多的母種，一次接種量要有100—200支試管，以便從中選擇。分離後應及時移入22℃—24℃恆溫箱或溫室中培養。由於培養基內水分較多，菌絲恢復要比耳木分離得快。經2-3天后，分離物的邊緣就可看 到白色菌絲。每天要至少觀察兩次，以便提純。觀察、提純方法與耳木分離法擔同。經適溫培養10-15天后，當接種塊扭結團出現紅、黃色水珠時，即可擴大原種。
（二）原種和栽培種的接種培養
母種獲得以後，為了滿足菌種生產的需要。應選出優良、純度高的母種進一步擴大為原種。
原種培養基一般採用棉籽殼、木屑、草類等培養基。
瓶裝或袋裝的原種培養基滅菌後，可送入滅過菌的接種箱內，待瓶中的培養基冷至30℃以下，可按照無菌操作程式進行接種。
菌種瓶（袋）放入培養室時，要經常進行檢查，一經發現雜菌汙染，立即取出。培養成的原種，菌絲體必須健壯有力，緊貼瓶壁而不幹縮，顏色純正，具有一定清香味，生活力強，擴製成栽培種時吃料快。
栽培種就是將原種進一步擴大培養成三級種，它和原種的接種及培養相同。一般香菇、平菇、冬菇、猴頭、木耳、銀耳的栽培種多用鋸木、棉皮作培養基。蘑菇多用糞草做培養料。
栽培種要求料塊不脫水乾縮。菌絲體健壯有力、顏色純正，有清香味，無老化現象，無雜菌汙染，有的種許可有少量原基，接入栽培料後，發菌快，長勢好，生活力強。
原種在接栽培種時，原種瓶口的一層菌絲體應挖去不用。
（三）液體種的簡單培養
目前，用液體深層發酵法生產菌種，具有生產量大、週期短、菌齡整齊、成本低廉、接種方便等特點，是實現食用菌工廠化生產的目標。現將液體種培育過程簡述於後，供參考。
簡言之就是將純正優良的菌種，接入液體培養基（固體培養基不加凝固劑），使菌絲繁殖形成大量小菌球，然後將這種培養基拌入木屑或棉籽皮料內，製成菌塊、培養其形成子實體。還可用於制原種、栽培種。
培養液體菌種，可將培養液裝入三角瓶中，約佔空瓶的五分之一重量。用搖瓶機（也稱搖床）來培養。搖瓶機有旋轉式和往復式兩種，一般多用往復式。液體培養基可用馬鈴薯汁（加糖），麥芽汁配製，也可用玉米粉、豆餅粉、糖、無機鹽等配製。可以混合培養基，因適用於多種食用菌和藥用菌的培養，均有好效果。組分：豆餅粉2％，玉米粉1％， 葡萄糖3％，酵母粉0.5％，磷酸二氫鉀0.1％，碳酸鈣 0.2％， pH自然， 12℃滅菌半小時。然後接種培養。
如果生產量較大，在三角瓶的基礎上，再逐級擴大種子缸，發酵罐中進行液體深層通氣發酵，產生大量菌種。但由於生產中要求裝置繁多，技術性強，我們還應創造條件實現食用菌栽培的現代化。
（四）菌種質量的鑑定
菌種質量鑑定最好的方法是，做出菇試驗。但是時間比較長。在購置菌種時，或在菌種生產中，如何能知菌絲生長情況，快速判斷菌種質量我們介紹幾種方法：
1、肉眼觀察：優良菌種菌絲濃白，絨狀，粗壯密集，生長整齊，速度快，香味濃厚。
2、優良菌種標準可歸納為："純、香、正、壯、潤"五個字。檢查時，開啟瓶塞，從菌種瓶中部取出小塊菌絲體，觀察色澤，聞其氣味，手捏料塊檢查其含水量，看是否符合上述要求標準。
3、顯微鏡檢查：挑取少量菌絲，置顯微鏡上觀察其形態，菌絲分枝，分隔情況，鎖狀聯合，細胞膜的厚薄。 培養觀察：從菌種瓶中挑取小塊菌絲體，接種斜面試管培養基上，置23℃～25℃恆溫中培養，經五週後檢查菌種生活力。如果菌絲生長快，旺盛純一，健壯濃厚，長且整齊，則表示菌種的生活力強。
4、分塊法：在桌上放一張白紙，把菌齡相同的菌種從瓶內取出一大塊，用手分成2塊，再把2塊分成4塊，4塊 分成8塊，依次進行。優良菌種整塊多，碎渣少。劣次菌整塊少，碎渣多。
5、液體菌種鑑別：當三角瓶或發酵缸培養3-7天后，如液麵出現氣泡，產生"油皮"、混濁等現象，說明菌種本 身帶有雜菌。如菌塊上浮，或遲遲長出很薄的菌絲層，則說明菌種生活力弱。白塊四周的菌絲生長快、濃白、棉絮狀，表明菌種生命力強。
（五）菌種生產過程中的雜茵防治
在生產菌種時，要時刻注意雜菌汙染，以防為主，一旦發生，根治很不容易。所以整個制種過程都必須在無菌條件下進行。接種箱及所有分離、接種的用具、器皿，都要進行嚴格的消毒滅菌。工作人員的雙手要用消毒劑清洗，並穿戴消過毒的工作服、帽和口罩，動作要敏捷、準確，儘量不要講話走動，以防空氣中的雜菌感染。
分離母種時，選擇出菇早、生活力強，第一潮菇是關鍵，因它生活力強，接種後迅速佔領陣地，無雜菌侵入的機會。
被汙染的菌種，原因是多方面的，一般是滅菌不徹底所致，或因接種時無菌操作不嚴、瓶蓋不合適造成的。所以滅菌一定要徹底，最好在接種萌將培養基置25℃左右溫箱中做效果檢查，經2天不長雜菌，說明徹底，可以使用，接種過程中一定要嚴格無菌操作。
汙染雜菌另一個原因可能是分離母種時感染雜菌，因種菇表面帶菌，消毒不徹底，通過組織塊將雜菌帶入培養基。
總之，汙染機會很多，要注意環境消毒，按無菌操作規程徹底滅菌，層層把關，環環抓緊，嚴加註意提離菌種質量。
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